Изучение роли IL-17 в патогенезе псориатического процесса

Тема диссертации и автореферата по ВАК 03.01.02, кандидат биологических наук Стародубцева, Наталия Леонидовна

Год: 2011, место защиты диссертации: Москва, Код cпециальности ВАК:03.01.02

Цель работы: изучить механизм действия IL-17 на клетки кожи при развитии псориатического процесса.

Задачи:

1. С помощью биоинформационного анализа базы данных (GEO DataSets) экспрессии генов при псориазе и анализа обогащения по онтологии канонических сигнальных карт построить сигнальные пути, ведущие от интерлейкина-17 через транскрипционные факторы к генам-мишеням.

2. Изучить изменение уровня экспрессии генов ключевых звеньев пути передачи сигнала от рецептора IL-17 при активной фазе псориатического процесса в пораженной коже относительно визуально непораженной.

3. Провести анализ изменений в экспрессии исследуемых генов при биофизическом воздействии на кожу лазерного излучения низкой интенсивности (А,=1.27нм) и интерференционных токов.

4. Изучить изменение в экспрессии исследуемых генов в культуре кератиноцитов кожи человека (первичных и иммортализованных) при индукции IL-17.

5. Верификация сигнального пути IL-17 при ингибировании процесса передачи сигнала от лиганда к рецептору антителами к IL-17RA в культуре кератиноцитов кожи человека.

Выводы

1. Проведенный биоинформационный анализ сетевых взаимодействий генов, с измененной при псориазе экспрессией, позволил построить сигнальный путь, ведущий от интерлейкина-17 через транскрипционные факторы (АР-1 и М^кВ) к генам-мишеням - матриксным металлопротеазам, являющийся, возможно, одним из ключевых в развитии патологического процесса при псориазе.

2. Экспериментально показано повышение экспрессии генов матриксных металлопротеаз - ММР-1, -9, -12 и /¿-77, и снижение экспрессии генов 4-х основных компонент транскрипционного фактора АР-1 - С-ЛТИ, Л1И-В, ЛШ-И и С-РОБ генов, в пораженной псориазом коже.

3. Впервые проведен анализ изменений в экспрессии исследуемых генов при лечебном биофизическом воздействии на кожу лазерного излучения низкой интенсивности (А,=1.27нм) и интерференционных токов показал нормализацию экспрессии исследуемых генов после успешно проведенной терапии у больных псориазом, что указывает на их важную роль в патогенезе псориаза.

4. Впервые получены данные, что индукция культуры как первичных, так и иммортализованных кератиноцитов интерлейкином 1Ь-17 активирует экспрессию генов металлопротеаз ММР-1, -9 -12.

5. Ингибирование процесса передачи сигнала от интерлейкина-17 приводит к снижению уровня экспрессии и синтеза матриксных металлопротеаз ММР-1, ММР-9 и ММР-12, что позволяет говорить о важной роли 1Ь-17 в пути активации данных генов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Псориаз является сложным многофакторным заболеванием с генетической предрасположенностью, которому подвержены около 4% населения Европы. Псориаз часто сопровождается другими аутоиммунными заболеваниями - например, у 10-30% больных псориазом также наблюдается псориатический артрит, приводящий к общему разрушению суставов [Nograles КЕ et al., 2009]. Кроме того, псориаз значительно повышает риск развития сердечнососудистых заболеваний и вероятность инфаркта [Gelfand JM et al., 2009].

В патогенез этого комплексного воспалительного заболевания кожи вовлечены такие процессы, как гиперпролиферация кератиноцитов и их аберрантная дифференцировка, ангиогенез дермы и др. [Gudjonsson JE et al., 2010].

Основной клинической симптоматикой псориаза является повышенная репродукция клеток эпидермиса и нарушение процессов их дифференцировки, что приводит к формированию дефектного рогового слоя на фоне воспалительного характера изменений в дерме.

Видимые тканевые изменения при псориазе, как полагают, обусловлены повышенным содержанием провоспалительных цитокинов, таких как TNF-a, IFN-y, IL-ip, IL-8, IL-12 и IL-17 [Hemdan NY et al., 2010]. Активированные Т-клетки высвобождают хемокины и ростовые факторы, которые запускают пролиферацию кератиноцитов, измененную дифференцировку и антигенные тканевые ответы. При этом окончательно образуются хронические бляшки, характеризующиеся внутриэпидермальными CD8+ Т-клетками и нейтрофилами. Эта фаза сопровождается утончением эпидермиса, образованием чешуек и ангиогенной реакцией ткани, что полностью отражает картину поврежденных участков на коже [Gudjonsson JE et al., 2010].

Таким образом, клиническая картина, наблюдаемая при псориазе, является результатом взаимодействий между иммунными клетками и кератиноцитами в коже. Именно изучению роли провоспалительных цитокинов (в том числе IL-17) и посвящены многие исследования, проведенные в последнее время. Если ранее изучение псориаза заключалось в измерении параметров клеточных инфильтратов, то в настоящее время начинается новый уровень исследований, направленных на изучение молекулярных путей патогенеза при псориазе и идентификацию белковых мишеней для фармакологического эффекта.

В этих исследованиях важнейшее значение имеет выявление механизмов регуляции экспрессии всех генов, задействованных в сложной сети, участвующей в развитии псориатического процесса.

На основании проведенного нами анализа баз данных мы идентифицировали ряд генов, которые в контексте с вышеизложенным представляются важными для исследования. В их числе гены, кодирующие транскрипционный фактор АР-1 {С-ЛЖ, ЛЖ-Д Ж-Д С-ТТО и РЯА-1), интерлейкин 1Ь-17 и матриксные металлопротеазы (ММР-1, -2, -9 и -12). Центральная роль членов АР-1-семейства объясняется их ответом на целый ряд внеклеточных стимулов, а также тем, что ШЫ, Р08 и АТ¥ белки становятся активными во многих биологических процессах, таких как эмбриональное развитие, ремоделирование тканей, опухолеобразование, воспаление и апоптоз, а также в ответ на действие радиации или химических канцерогенов. С помощью биоинформационного анализа был предложен путь действия 1Ь-17 на кератиноциты через транскрипционные факторы АР-1 и ЫБ-кВ, ведущий к активации генов-мишеней матриксных металлопротеаз-1,-2, 9 и -12.

Для подтверждения присутствия построенного нами пути действия 1Ь-17 на клетки кожи в патогенезе псориаза мы исследовали уровень экспрессии гена интерлейкина-17, генов транскрипционного комплекса АР-1 и генов-мишеней металлопротеаз внеклеточного матрикса {ММР-1, ММР-2, ММР-9 и ММР-12). С помощью метода ПЦР в реальном времени мы обнаружили снижение экспрессии генов транскрипционного комплекса АР-1 (С-ЛШЛМ-В, ЛШ-И и С-РО^ в коже больных псориазом. Имеющиеся в литературе данные также свидетельствуют о сильном снижении экспрессии нз

JUN белков в пораженной псориазом коже [Zenz R. et al., 2005] и о том, что комплекс C-JUN/JUN-B является негативным регулятором псориатического процесса [Vandal К. et al., 2003], что согласуется с полученными нами результатами. Ранее уже сообщалось о повышении экспрессии ММР-1 и ММР-9 при псориазе, однако оверэкспрессия ММР-12 показана нами впервые. Повышение экспрессии матриксных металлопротеаз, видимо, связано с ремоделированием эпителия, привлечением макрофагов и лейкоцитов при образовании бляшки.

Изменение экспрессии исследуемых генов (повышение - ММР-1, -9, -12, IL-17 и снижение - C-JUN, JUN-B, JUN-D и C-FOS) в псориатических бляшках, по сравнению с визуально непораженной кожей, нормализация экспрессии этих генов после терапевтического воздействия интерференционными токами или лазерным излучение низкой интенсивности говорят о значимости данных генов в патогенезе псориаза. Лечебный эффект биофизического воздействия интерференционных токов и лазерного излучения низкой интенсивности при терапии псориаза, по-видимому, связан с нормализацией ими разрегулированной работы генов через активацию трансмембранных рецепторов и протеинкиназ, участвующих при передаче сигнала IL-17 в ядро клеток. Ранее было показано, что уровень ММР-1 повышен в плазме крови и псориатических бляшках больных псориазом, коррелирует с коэффициентом PASI и даже может рассматриваться в качестве одного из маркеров псориатического процесса [Flisiak I. et al, 2008]. Повышенная экспрессия гена ММР-12 на уровне мРНК в псориатических бляшках показана нами впервые и не противоречит данным о повышенном уровне ММР-12 в макрофагах пораженной псориазом кожи [Suomela S. et al., 2001]. Повышение экспрессии генов ММР-1, -9 и -12 при псориатическом процессе позволяет предложить использование их в качестве критерия состояния патологического процесса и эффективности лечения.

Следует отметить, что полученные данные по изменению экспрессии генов в бляшках нормированы на уровень экспрессии в визуально непораженной коже пациентов. Ранее уже отмечалось отличие визуально непораженной кожи при псориазе и кожи здорового человека как на гистологическом (увеличение толщины дермы, количества резидентных лимфоцитов), так и на молекулярном уровнях. С использованием антител к ММР-12 мы показали накопление этой металлопротеазы в псориатических бляшках, снижение уровня ММР-12 в визуально непораженной коже и практически полное отсутствие синтеза ММР-12 в коже здоровых людей.

Нами было доказано, что действие провоспалительного цитокина (1Ь-17) на первичные и иммортализованные кератиноциты (основные клетки, задействованные в моделировании эпидермиса при псориазе) связано с активацией в них синтеза тех же металлопротеаз, что и при псориатическом процессе (ММР-1, -9 и -12). Это подтверждает созданный при биоинформационном анализе путь действия 1Ь-17 на кератиноциты при патогенезе псориаза, в результате которых бессимптомная кожа превращается в пораженную псориатическими бляшками. Полученные результаты дополняют существующую цитокиновую модель патогенеза псориаза и могут способствовать идентификации новых мишеней лекарственных препаратов для лечения заболевания.



Научная библиотека диссертаций и авторефератов disserCat http://www.dissercat.com/content/izuchenie-roli-il-17-v-patogeneze-psoriaticheskogo-protsessa#ixzz4bIyoQqo8