Изучение экспрессии генов C-JUN, JUN-B, JUN-D и C-FOS для оценки эффективности лечения псориаза низкоинтенсивным лазерным излучением
В. В. Соболев, Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН
А. Г. Соболева, Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН
А. Д. Золотаренко, Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН
А. А. Николаев, Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН
И. М. Корсунская, Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН, Москва; Первый МГМУ им. И.М. Сеченова
М. Ш. Миннибаев, Первый МГМУ им. И.М. Сеченова
С. А. Брускин, Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН
Псориаз — хроническое воспалительное заболевание кожи, основным клиническим проявлением которого (Psoriasis vulgaris) являются четко разграниченные эритематозные бляшки, покрытые серебристо-белой чешуей [1].
Гистологическая картина патологии представляет собой заметное утолщение эпидермального слоя по сравнению с тканями нормальной кожи (эпидермальная гиперплазия), причиной которого являются гиперпролиферация и ненормальная дифференцировка кератиноцитов (или ее отсутствие) [2, 3]. Также наблюдается инфильтрация воспалительных клеток (лимфоциты, моноциты и нейтрофилы) и васкулярные изменения (в слое эндотелиальных клеток).
Псориаз является типичным комплексным заболеванием с гетерогенной генетической наследуемостью [4]. Профилирование генной экспрессии при псориазе свидетельствует о том, что он является иммунноопосредованным воспалительным заболеванием, при котором дисбаланс в эпидермальной клеточной структуре, росте и дифференциации возникает из-за молекулярных стрессовых сигналов, инициирующих иммунные ответы [5]. В исследованиях показана дифференциальная экспрессия генов, связанных с регенерацией, гиперкератозом, иммунным ответом и воспалением в псориатических бляшках кожи. Установлены сигнальные пути, участвующие в развитии псориатического процесса. Так, например, отмечена роль ряда генов транскрипционного фактора АР-1 в развитии псориаза [5, 6].
AP-1 — общее название группы парных белковых комплексов с разным субъединичным составом. Образующие AP-1 мономеры входят в семейства ДНК-связывающих белков — JUN, FOS и ATF. В семейство JUN входят белки C-JUN, JUN-B и JUN-D. По сравнению с другими субъединицами наибольшее число димеров AP-1 образуется при участии белка C-JUN, который создает стабильные парные комплексы со всеми 36 белками семейств JUN и FOS и большинством белков семейства ATF. Гетеродимер C-JUN:JUN-B имеет более низкое сродство к участкам связывания ДНК. По этой причине JUN-B ослабляет зависимую от C-JUN индукцию ряда генов [7].
Наиболее функционально активные изоформы AP-1 образованы парами смешанного состава, состоящими из C-JUN и JUN-B или C-FOS и FOS-B [7].
На основании анализа данных литературы и баз данных мы идентифицировали ряд генов, кодирующих транскрипционный фактор AP-1 (c-jun, Jun-B, Jun-D, c-fos, Fos-B и другие), которые в контексте с изложенным выше представляются важными для исследования.
Анализ профилей экспрессии РНК, кодируемых перечисленными генами, в образцах пораженной псориазом кожи и визуально непораженной коже тех же больных до и после лечения лазерным излучением низкой интенсивности является важным аспектом проводимых нами в настоящее время исследований.
Материал и методы
Биоптатов кожи больных псориазом (бляшечного типа) Psoriasis vulgaris из пораженного и непораженного участков кожи брали под местной анестезией с помощью дерматологического пробойника (4 мм). Биопсии из непораженных участков кожи брали на расстоянии около 3 см от пораженной кожи [8]. Исследование одобрено комитетом по этике при Институте общей генетики РАН и соответствует принципам, изложенным в Декларации Хельсинкского соглашения.
На I этапе работы пациенты не получали какой-либо системной или PUVA/UV терапии в течение 1 мес до взятия биопсии кожи. На II этапе пациенты проходили курс лечения низкоинтенсивным лазерным излучением (НИЛИ) с длиной волны 1,27 мкм (коротковолновая часть инфракрасного диапазона). Для определения эффективности терапии до и после лечения исследовали биоптаты кожи.
Выделение РНК из биопсий проводили на колонках Qiagen по стандартному протоколу RNeasy Mini Kit для кожи.
Для освобождения препаратов РНК от примесей ДНК проводили обработку ДНазой Qiagen.
Обратную транскрипцию проводили следующим образом. В пробирки для полимеразной цепной реакции (ПЦР) объемом 200 мкл вносили буфер, dNTP, 100 ЕД обратной транскриптазы M-MLV (Promega), 20 ЕД ингибитора РНКаз RNasin (Promega), 500 нг oligo(dT)12-18 праймеров (ДНК-Синтез) и РНК до конечной концентрации не более 100 нг/мкл. Смесь термостатировали 1 ч при 37 °С.
ПЦР в реальном времени проводили в 96-луночных оптических плашках с использованием меченных флюоресцентными агентами олигонуклеотидных проб. Реакцию проводили с использованием 2,5-кратной реакционной смеси с референсным красителем ROX (Синтол).
Праймеры и пробы были синтезированы фирмой «ДНК-Синтез» (табл. 1).
(табл. 1)
Амплификацию проводили в ПЦР-амплификаторе (Bio-Rad, iQ4), используя следующую программу: 1) денатурация при 95 °С в течение 4 мин; 2) денатурация при 94 °С в течение 15 с; 3) отжиг при 58 °С в течение 15 с; 4) элонгация при 72 °С в течение 15 с; 5) этапы 2—4 повторяли 35 раз. Экспрессию генов-мишеней нормализовали на ген домашнего хозяйства GAPDH. Амплификацию гена GAPDH и проводили в разных пробирках.
Обработку результатов ПЦР проводили методом 2-ΔΔCT, который показывает, во сколько раз изменяется экспрессия гена в пораженном образце по сравнению с непораженным. ΔΔCt рассчитывалось как ΔΔCt=ΔCt(пораженной кожи)—ΔCt(непораженной кожи) и каждое значение ΔCt=ΔCt(исследуемый ген)—ΔCt(GAPDH) [9].
Эксперименты проводили в 3-х кратной повторности для каждого образца.
Для оценки состояния псориаза использовали индекс охвата и тяжести псориаза PASI (Psoriasis Area and Severity Index). Для каждой части тела вычисляли локальный PASI: PASI=Доля×Охват×(Краснота+Шелушение+Толщина). Суммарный итоговый PASI равен сумме локальных и может изменяться в диапазоне от 0 до 72. Максимальное значение индекса PASI в данной группе составило 32, минимальное — 1,9 (табл. 2).
(табл. 2)
Результаты и обсуждение
Анализ профилей экспрессии РНК проводился по 48 образцам кожи, взятых у 12 пациентов. На I этапе исследования анализировали биоптаты кожи одних и тех же пациентов, пораженной и не пораженной псориатическим процессом. На II этапе анализировали образцы пациентов, часть которых проходила лечение НИЛИ.
Механизм действия лазерного излучение исследован довольно слабо. Сочетание воздействия лазерного излучения и магнитного поля (30 мТл) в используемом нами приборе Мустанг 2000+ обеспечивает увеличение глубины проникновения лазерного излучения в ткани за счет их поляризации магнитным полем. НИЛИ инфракрасного диапазона преимущественно поглощается молекулами белка, воды, кислорода и углекислоты, которые переходят в возбужденное состояние, активнее участвуют в физических и физико-химических взаимодействиях. Поглощение энергии приводит к резкому увеличению внутриклеточной концентрации Ca2+ и стимуляции кальцийзависимых процессов: ускорению течения внутриклеточных биохимических реакций свободнорадикального типа, увеличению содержания свободных биологически активных молекул, активации накопления и высвобождения аденозинтрифосфата, восстановлению клеточных мембран, активации пролиферации. Происходит неспецифическая стимуляция биохимической активности тканей, подверженных лазерному облучению. Молекулярные акцепторы НИЛИ, связанные с клеточными мембранами, переходят в электронно-возбужденное состояние, повышая биоэнергетическую активность мембранных комплексов и фиксированных на мембранах ферментативных систем, поддерживающих жизнедеятельность и синтетические процессы в клетке. Таким образом, при воздействии НИЛИ на кожу происходит ликвидация воспалительных процессов, реконструкция эпидермиса и дермы, что ведет к исчезновению псориатических бляшек.
После лечебного воздействия НИЛИ наблюдалось достоверное увеличение экспрессии C-JUN (экспрессия повышена в интервале от 0,31 у 8-го пациента до 2,7 раза у 10-го), кроме 6 и 9-го пациентов (недостоверное снижение экспрессии данного гена; рис. 1).
Рисунок 1. Изменение уровня экспрессии гена C-JUN у пациентов 1-й группы до и после лечения НИЛИ. За 1 принят уровень в визуально непораженной псориазом коже. * — р<0,001, ** — p<0,05, *** — p>0,1.Достоверность отличий между выборками (до и после лечения) составила p<0,001. Среднее значение изменения уровня экспрессии гена C-JUN после лечения оказалось сниженным в 1,4±0,2 раза. В среднем уровень экспрессии гена повысился по данной выборке в 1,5—3,0 раза.
После лечения НИЛИ уровень экспрессии гена C-FOS оказался выше, чем до лечения — от 0,12 (пятый пациент ) до 3,2 раза (шестой пациент) выше контроля (рис. 2).
Рисунок 2. Изменение уровня экспрессии гена C-FOS у пациентов 1-й группы до и после лечения НИЛИ. За 1 принят уровень в визуально непораженной псориазом коже. p<0,001.При сравнении экспрессии гена C-FOS до и после лечения наблюдалось достоверное повышение значения показателя у всех пациентов. Значимость отличий между выборками (до и после лечения) составила p<0,001. Среднее значение изменения уровня экспрессии гена после лечения было повышено в 1,6±0,3 раза, т.е. уровень экспрессии гена в среднем повысился по данной выборке в 2,9—5,7 раза.
После лечения уровень экспрессии гена JUN-B в целом оказался выше, чем до лечения — от 0,32 (11-й пациент) до 2,5 раза (9-й) выше контроля. При сравнении экспрессии гена JUN-B до и после лечения наблюдалось достоверное повышение у всех пациентов, кроме 5-го (рис. 3).
Рисунок 3. Изменение уровня экспрессии гена JUN-B у пациентов 1-й группы до и после лечения НИЛИ. За 1 принят уровень в визуально непораженной псориазом коже. * — р<0,01, ** — p<0,05.Достоверность отличий между выборками составила p<0,005. Среднее значение изменения уровня экспрессии гена после лечения оказалось повышенным в 1,5±0,2 раза.
В среднем уровень экспрессии гена повысился по данной выборке в 1,7—3,1 раза.
После лечебного воздействия НИЛИ уровень экспрессии гена JUN-D повысился — от 0,25 (8-й пациент) до 5,9 раза (4-й) выше контроля. При сравнении экспрессии гена JUN-D до и после лечения наблюдалось достоверное повышение значения данного показателя у всех пациентов, кроме 1-го (уровень экспрессии гена после лечения оказался недостоверно понижен; рис. 4).
Рисунок 4. Изменение уровня экспрессии гена JUN-D у пациентов 1-й группы до и после лечения НИЛИ. За 1 принят уровень в визуально непораженной псориазом коже. * — р<0,001, ** — p<0,05, *** — p>0,1.Значимость отличий между выборками составила p<0,01. Среднее значение изменения уровня экспрессии гена после лечения оказалось повышенным в 1,4±0,4 раза.
В среднем уровень экспрессии гена повысился по данной выборке в 1,8-5,6 раза.
При сравнении изменения экспрессии генов компонент АР-1 комплекса при воздействии НИЛИ экспрессия генов C-JUN, C-FOS, JUN-B и JUN-D достоверно (р<0,05) увеличилась в среднем в 2,3, 4,2, 2,4 и 3,7 раза соответственно (рис. 5).
Рисунок 5. Сравнение уровня экспрессии генов C-JUN, C-FOS, JUN-B и JUN-D в образцах пораженной псориазом кожи до и после лечения НИЛИ. За 1 принят уровень экспрессии в визуально непораженной коже. * — р<0,001, ** — p<0,01 (непараметрический метод Манна-Уитни).
Достоверное повышение экспрессии генов C-JUN, C-FOS, JUN-B и JUN-D, подавляемых при активной стадии псориаза НИЛИ с длиной волны 1,27 мкм, позволяет говорить о высокой терапевтической эффективности этого метода и о значимости данных генов в патогенезе псориаза.
Работа выполнена при поддержке Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине», ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России» ГК 16.512.11.2049 и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» ГК П1309.
www.mediasphera.ru/issues/klinicheskaya-dermatologiya-i-venerologiya/2013/1/031997-2849201313
