ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТАГОНИСТА РЕЦЕПТОРА ИНТЕРЛЕЙКИНА 36 ЧЕЛОВЕКА И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

 

Колобов Алексей Александрович

 

 

 

Актуальность темы исследования

 

Работа проводилась в рамках проекта по разработке перспективных подходов к терапии псориаза.

 

Псориаз является многофакторным заболеванием, поражающим до 5% населения в экономически развитых странах. Псориатический артрит развивается у 5-25% больных псориазом, проявляется симметричными деструктивными изменениями суставов (Boehncke, Schön, 2015). В России проживает более 300 тысяч больных псориазом (Мишина et al., 2012). Помимо вульгарного псориаза выделяют более тяжёлые формы заболевания, характеризующиеся обширными болезненными высыпаниями, их особенной локализацией, образованием пустул, поражением суставов и системными расстройствами. Наиболее тяжёлой формой псориаза является генерализованный пустулёзный псориаз (ГПП).

 

Для лечения среднетяжелых и тяжелых форм псориаза, наряду со средствами местного лечения и системными иммунодепрессантами (Kelly et al., 2015) в последние год широкое применение получили фармацевтические препараты с антицитокиновой активностью. Высокую клиническую эффективность демонстрируют препараты, нейтрализующие биологическую активность фактора некроза опухолей-альфа (Saikaly, Mattes, 2016), блокаторы рецептора интерлейкина (ИЛ)-12 и ИЛ-23 (Papp et al., 2015), терапевтические антитела против ИЛ-17А (Ryoo et al., 2016).

 

Важную роль в активации и поддержании воспаления в коже, пораженной псориазом, играют цитокины семейства ИЛ-36. Это семейство включает три провоспалительных цитокина - ИЛ-36α, ИЛ-36β и ИЛ-36γ - и специфический антагонист рецептора ИЛ-36 (ИЛ-36РА). Ряд мутаций в гене IL36RN, кодирующем ИЛ-36РА, способен вызывать развитие генерализованного пустулёзного псориаза.

 

Предполагается, что блокада активации рецептора ИЛ-36 с помощью введения рекомбинантного ИЛ-36РА человека может быть высокоэффективным подходом к терапии данного дерматоза. В связи с этим разработка новых лекарственных средств на основе ИЛ-36РА для лечения псориаза является актуальной задачей.

 

Настоящее исследование посвящено разработке методик получения рекомбинантного ИЛ-36РА человека в бактериальном продуценте и его очистки, а также изучению физико-химических свойств и биологической активности полученного цитокина. Результаты проведенных исследований легли в основу лабораторного и опытно-промышленного регламентов получения фармацевтической субстанции ИЛ-36РА.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

 

Поскольку для полной биологической активности ИЛ-36РА необходимо отщепление инициаторного остатка метионина, нами разработан способ получения безметионинового ИЛ-36РА в Escherichia coli. Создана серия плазмид, несущих ген метионинаминопептидазы (МАП) E. coli под контролем различных промоторов, для коэкспресии ИЛ-36РА и МАП и протестировано их влияние на продукцию ИЛ-36РА. Наибольшая продукция ИЛ-36РА с содержанием менее 5% непроцессированной формы с неотщеплённым инициаторным остатком метионина показана нами для штамма E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A), в котором ген МАП контролировался индуцируемым арабинозой промотором. Полученный ИЛ-36РА обладал биологической активностью, соответствующей активности ИЛ-36РА, выпускаемого фирмой R&D Systems (США). Разработанный нами способ получения ИЛ-36РА, включающая культивирование штамма E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) в биореакторах объёмом до 250 л, позволяет получить значительно большие количества целевого белка, чем методики, предложенные ранее другими авторами (Towne et al., 2011; Günther, Sundberg, 2014).

 

Установлено, что в процессе выделения и хранения при рН > 7.0 ИЛ-36РА подвергается дезамидированию. Для оценки содержания дезамидированной формы ИЛ-36РА в получаемом препарате разработан метод анализа на основе кИЭФ. Технология получения и хранения белка оптимизирована для минимизации этих модификаций.

 

Разработаны три методики хроматографической очистки ИЛ-36РА, пригодные для очистки ИЛ-36РА из биомассы культур различных объёмов. Наиболее прогрессивная из них позволяет в течение трехнедельного производственного цикла получать 8-10 г высокоочищенного ИЛ-36РА.

 

Наработанный белок использован для проведения доклинических исследований эффективности и безопасности разрабатываемого во ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» лекарственного средства на основе ИЛ-36РА для лечения тяжёлых форм псориаза. Было показано отсутствие острой токсичности в дозах до 200 мг/кг (в 2000 раз превосходит расчётную терапевтическую дозу для человека), хронической токсичности (20 мг/кг 90 дней), репродуктивной токсичности, пирогенности, мутагенности и аллергенности.

 

ВЫВОДЫ

 

1. Создана и охарактеризована серия штаммов-продуцентов безметионинового рекомбинантного ИЛ-36РА человека на основе E. coli BL21 DE3, трансформированных одной их плазмид, несущих ген метионинаминопептидазы E. coli (map) под контролем различных промоторов, и плазмидой, несущей ген ИЛ-36РА человека (IL36RN). Штамм E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) является наиболее продуктивным и обеспечивает получение ИЛ-36РА с содержанием непроцессированной формы менее 5%.

 

2. Оптимизирована методика культивирования штамма E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) для применения в биореакторах объёмом до 250 л, что позволяет получить до 24 г неочищенного ИЛ-36РА от одного запуска биореактора.

 

3. Разработаны три способа хроматографической очистки ИЛ-36РА из биомассы культур различных объёмов, которые позволяют получать препарат ИЛ-36РА с чистотой более 95% по ОФ-ВЭЖХ, содержащий менее 5% дезамидированной формы и менее 10 EU ЛПС на мг белка. Наиболее прогрессивная методика позволяет получить 8-10 г очищенного ИЛ-36РА за один производственный цикл.

 

4. Установлено, что ИЛ-36РА в процессе выделения и хранения при рН > 7,0 подвергается дезамидированию. Для оценки содержания дезамидированой формы ИЛ-36РА разработан метод анализа на основе кИЭФ.

 

5. Подобраны условия хранения ИЛ-36РА, минимизирующие дезамидирование ИЛ-36РА. Разработан состав фармацевтической субстанции ИЛ-36РА. Образцы ФС ИЛ-36РА хранятся в растворе этого состава не менее года без изменений своих свойств.

 

6. Биологическая активность получаемого по разработанной методике в масштабе пилотного промышленного производства ИЛ-36РА в модельной системе in vitro на основе клеток линии А549, трансфицированных плазмидой, несущей ген рецептора ИЛ-36, соответствует биологической активности коммерческого стандартного препарата. Получаемый ИЛ-36РА способен купировать развитие воспаления in vivo в модели псориазоподобного дерматита на мышах.

 

Download
ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТАГОНИСТА РЕЦЕПТОРА ИНТЕРЛЕЙКИНА 36 ЧЕЛОВЕКА И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И
ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТАГОНИСТА РЕЦЕПТОРА ИНТЕРЛЕЙКИНА 36 ЧЕЛОВЕКА И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
6xhJ6BDvMv.pdf
Adobe Acrobat Document 814.2 KB