Патент на вещество, предназначенное для лечения псориаза (диацереин)

 

ДИ НАПОЛИ Гвидо (CH) АБОРАТУАР МЕДИДОМ С.А. (CH)

 

 

 

 Изобретение касается веществ, предназначенных для лечения псориаза и связанных с ним заболеваний.

 

Уровень техники

 

Псориаз - это гетерогенное хроническое воспалительное заболевание кожи неизвестной этиологии.

 

Распространенность псориаза в мировой популяции человека оценивается приблизительно в 2-3%, причем псориаз варьирует от минимальных поражений локтей и колен до большого числа повреждений, разбросанных по всей коже, с равным поражением мужчин и женщин.

 

Псориаз может проявиться в любой части кожных покровов на локтях, коленях, голове и ногтях.

 

У большинства больных psoriasis vulgaris проявляется в легкой или умеренной форме и поражает менее 20% поверхности кожи.

 

Классический псориаз проявляется в виде папул (узелков) и бляшек со слоями чешуек, причем эти повреждения эритематозны, покрыты слоем серебристо-белых чешуек и четко отделяются от окружающей кожи.

 

Однако псориаз может проявляться в различных формах и может сопровождаться различными формами воспалительного артрита, включая асимметричный олигоартрит, симметричный артрит, спондилоартрит и деформирующий артрит.

 

Например, по оценкам псориатический артрит поражает от 2,7 до 7% от общей популяции больных псориазом и в большинстве случаев он появляется через несколько лет после возникновения псориаза.

 

Гистологически псориаз характеризуется эпидермальной гиперпролиферацией/гиперплазией, возникающей вследствие инфильтрации воспалительных кератиноцитов в кожу, усиленной васкуляризацией и высвобождением провоспалительных цитокинов, таких как IL-1, IL-6, IL-8 и -TNF.

 

Этиопатогенез псориаза и связанного с ним артрита (PsA) все еще не имеет исчерпывающего объяснения, но признается, что важную роль в развитии и проявлении этих заболеваний играют генетические, иммунологические факторы и факторы внешней среды.

 

Роль генетического фактора в этиологии и патогенезе псориаза и связанного с ним псориатического артрита подтверждают исследования на близнецах, представленные Espinoza L.R. в "Proceedings of the XIX ILAR Congress of Rheumatology 1997, Singapore, pp.262-263".

 

Исследования в этой области также свидетельствуют о прямой роли иммунной системы в патогенезе псориаза и связанного с ним псориатического артрита.

 

Прежде всего, присутствие лимфоцитов CD4+ и CD8+ в коже и синовиальных мембранах означает, что эти клетки участвуют в этих заболеваниях.

 

Кроме того, о роли иммунной системы, в особенности Т-клеток, свидетельствует действие иммунносупрессорных препаратов на воспалительный процесс при псориазе как в коже, так и в синовиальной оболочке, причем некоторые иммуносупрессоры, включая метотрексат и циклоспорин А, весьма эффективны при лечении псориаза и связанного с ним псориатического артрита.

 

Кроме того, Espinoza показал, что псориатические фибробласты вносят значительный вклад в воспалительные и пролиферативные изменения, наблюдаемые при псориазе и связанном с ним псориатическом артрите.

 

Псориатические фибробласты кожи и синовиальной оболочки проявляют изменения в клеточном цикле ДНК и в ответах на факторы роста, вызывают усиление экспрессии -рецептора к фактору роста из тромбоцитов (PDGF) и синтеза интерлейкинов IL-1 , IL-8 и PDGF, а также конститутивно экспрессируют IL-6.

 

Это означает, что при псориазе и связанном с ним псориатическом артрите экс-прессируются IL-1 , IL-6 и IL-8, которые являются провоспалительными цитокинами.

 

Далее, в синовиальной жидкости больных псориазом и связанным с ним артритом были обнаружены высокие уровни фактора некроза опухолей ( -TNF), IL-1, IL-6 и IL-8.

 

Применяемые в настоящее время способы лечения псориаза можно разделить на три основные категории: местное лечение, светолечение и системное лечение (циклоспорин, метотрексат, пероральные ретиноиды).

 

Описано большое число фармацевтических композиций, применяемых при лечении псориаза с различной степенью успешности, которые часто сопровождаются нежелательными побочными эффектами.

 

Более того, применяемые в настоящее время способы лечения псориаза не способны излечить заболевание и их цель заключается лишь в снижении тяжести и распространения поражений кожи.

 

До настоящего изобретения не было эффективного терапевтического способа лечения псориаза и связанных с ним осложнений, таких как псориатический артрит.

 

Принимая во внимание серьезность псориаза и связанных с ним заболеваний и относительно высокую распространенность их в общей популяции человека, а также учитывая, что псориаз описывали и исследовали с самого начала девятнадцатого века, существует ощутимая долгожданная потребность в эффективном терапевтическом способе лечения псориаза и связанных с ним заболеваний.

 

Цель настоящего изобретения заключается в получении вещества, применимого при лечении псориаза и связанных с ним заболеваний.

 

Согласно настоящему изобретению эта цель была достигнута в результате неожиданного открытия, что при лечении псориаза и связанных с ним заболеваний оказался полезным диацереин.

 

Диацереин, также известный как диацетилреин или 4,5-бис(ацетилокси)-9,10-дигидро-9,10-диоксо-2-антраценкарбоновая кислота (см. The Merck Index, Twelfth Edition, 1996, Product No. 3003, pages 501-502), является производным антрахинона и имеет следующую структуру:

 

Он известен по его применению при лечении ревматоидного артрита и остеоартрита, как описано, к примеру, в US-A-4244968 (Prof. C.A. Friedman), EP-B-0520414 (Madaus AG) и EP-B-0636602 (Laboratoire Medidom S.A.).

 

Предлагались различные композиции для парентерального или перорального введения производных диацереина.

 

Полезный препарат для перорального введения описан, к примеру, в ЕР-А-0264989.

 

В то время, как диацереин и его производные рассматривались как полезные для лечения ревматоидного артрита и остеоартрита, которые сероположительны к ревматоидному фактору, до настоящего времени они не рассматривались в отношении лечения псориаза и связанных с ним заболеваний типа псориатического артрита, которые сероотрицательны к ревматоидному фактору.

 

Механизм действия диацереина и его производных при лечении псориаза и связанного с ним артрита (PsA) не совсем ясен, однако, было показано, что диацереин и его активный метаболит реин ингибируют синтез и активность провоспалительных катаболических цитокинов семейства IL-1, особенно IL-1 , и антагонисты рецептора IL-1 (IL-1rа), а также ингибируют IL-6 и другие цитокины - -TNF и LIF.

 

Поэтому предполагается, что указанные выше эффекты диацереина на цитокины являются одним из возможных объяснений его эффективности при лечении псориаза, поскольку в синовиальной жидкости больных псориазом и псориатическим артритом наблюдаются высокие уровни -TNF, IL-1, IL-6 и IL-8.

 

Один из аспектов настоящего изобретения касается применения диацереина или его фармацевтически приемлемого производного для получения фармацевтической композиции для лечения псориаза и связанных с ним заболеваний.

 

Другой аспект настоящего изобретения касается применения диацереина или его фармацевтически приемлемого производного для получения фармацевтической композиции для лечения псориаза.

 

Следующий аспект настоящего изобретения касается применения диацереина или его фармацевтически приемлемого производного для получения фармацевтической композиции для лечения псориаза и псориатического артрита.

 

Следующий аспект настоящего изобретения касается применения диацереина для получения фармацевтической композиции для лечения псориаза.

 

Следующий аспект настоящего изобретения касается применения диацереина для получения фармацевтической композиции для лечения псориаза и псориатического артрита.

 

Следующий аспект настоящего изобретения касается способа лечения псориаза, который включает введение фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество диацереина или его фармацевтически приемлемого производного.

 

Следующий аспект настоящего изобретения касается способа лечения псориаза и псориатического артрита, который включает введение фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество диацереина или его фармацевтически приемлемого производного.

 

Настоящее изобретение удовлетворяет долгожданную потребность, обеспечивая особенно эффективное лечение псориаза и связанных с ним заболеваний путем применения диацереина или его фармацевтически приемлемого производного.

 

Преимущество применения диацереина заключается в том, что он хорошо переносится и не проявляет канцерогенности, поскольку диацереин уже широко применялся для лечения остеоартрита и ревматоидного артрита и подвергался обширным токсикологическим исследованиям.

 

Другое преимущество диацереина состоит в том, что он не влияет на образование простагландина PGE2 и поэтому не обладает гастротоксическими свойствами.

 

Другие достоинства настоящего изобретения станут ясными из последующего подробного описания.

 

В настоящем изобретении можно использовать любой диацереин, имеющий достаточную степень чистоты для применения в фармацевтической композиции.

 

Согласно Merck Index, Twelfth Edition, диацереин может быть синтезирован в соответствии с A. Tschirch, К. Heuberger, Arch. Pharm. 240, 596 (1902); V.K. Murty et al., Tetrahedron 23, 515 (1987).

 

Известные композиции, содержащие диацереин - это, к примеру, Artrodar®, Art50®, Zondar50®, Fisiodar®, Artrofast®, Verboril®, Matrix®, Cartivix® и Artrolyt® (распространяются во Франции, Италии, Греции, Португалии, Израиле, Бразилии, Аргентине и Перу фирмой Laboratoire Medidom S.A. (Женева) или по лицензии этой фирмы), причем эти композиции поступают в продажу для лечения остеоартрита.

 

Несколько способов получения диацереина посредством экстракции или синтеза защищены патентами или патентными заявками, владельцем которых или лицензий на них является фирма Laboratoire Medidom S.A. (Женева) (например, см. ЕР-В-0636602 и ЕР-В-0520414).

 

В настоящем изобретении можно использовать любое фармацевтически приемлемое производное диацереина, у которого кислотная группа диацереина находится в виде соли или эфира.

 

Неограничивающие примеры производных диацереина, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают соли щелочных или щелочноземельных металлов, например соли натрия, калия, магния, кальция и т.д., и эфиры спиртов C16, например метанола, этанола и т.д.

 

Однако предпочтительно применяется диацереин.

 

В настоящем изобретении из диацереина предпочтительно получают фармацевтические композиции, предназначенные для приема внутрь.

 

Фармацевтические композиции, предназначенные для приема внутрь, - это сиропы, таблетки, капсулы и т.п.

 

Когда фармацевтическая композиция предназначена для приема внутрь, дозировки предпочтительно находятся в пределах 30-200 мг в день, более предпочтительно 100 мг в день.

 

Дневные дозы предпочтительно принимают, по меньшей мере, в два приема.

 

Особенно эффективная дозировка диацереина при приеме внутрь для лечения псориаза - 100 мг два раза в день на протяжении, по меньшей мере, 6 месяцев.

 

Фармацевтические композиции, содержащие диацереин или его фармацевтически приемлемые производные, также могут быть составлены в виде крема или мази для местного нанесения на те области кожного покрова, которые затронуты псориазом, например гиперкератозные участки.

 

Когда фармацевтическая композиция предназначена для местного нанесения, дозировку композиции и частоту нанесения выбирают, исходя из соображений эффективности.

 

Фармацевтические композиции, содержащие диацереин или его фармацевтически приемлемые производные, могут быть получены просто путем смешивания диацереина или его фармацевтически приемлемого производного с соответствующими стандартными наполнителями и доведения композиции до соответствующей лекарственной формы или же любым подходящим традиционным методом.

 

Для раскрытия сущности настоящего изобретения перейдем теперь к его подробному описанию на примерах, включая опыты in vitro, клинические испытания и фигуры.

 

Материалы и методы

 

В настоящих опытах использовали чистый диацереин.

 

Культуры кератиноцитов

 

Кератиноциты эпидермиса человека получали из крайней плоти путем отделения полосок эпидермиса при обработке диспазой II (5 мг/мл, 60 минут при 37°С, Boehringer Mannheim, Германия).

 

Эпидермис инкубировали в 0,25% трипсине/0,02% ЭДТА в течение 20 минут при 37°С и разобщали механически.

 

Суспензии эпидермальных клеток высевали (2,5×10 4/см2) на обработанные митомицином С клетки 3T3-J2 (2,4×104/см2, АТСС, Rockville, MD, США) и выращивали в увлажненной атмосфере с 5% СО2 в среде для выращивания кератиноцитов, состоящей из модифицированной Дюльбекко среды Игла и среды F12 Хэма (смесь 3:1, Biochrom KG, Berlin, Германия) и содержащей телячью сыворотку (10%, ICN Biomedicals, Aurora, Ohio), инсулин (5 мг/мл, Sigma, St. Louis, МО, США), трансферрин (5 мг/мл, Sigma), аденин (0,18 мМ, Sigma), гидрокортизон (0,4 мг/мл, Sigma), трииодотиронин (20 пМ, Sigma), холерный токсин (0,1 нМ, Sigma), фактор роста эпидермиса (10 нг/мл, Sigma), глутамин (4 мМ, Sigma) и пенициллин/стрептомицин (50 ЕД/мл, Biochrom).

 

В первичных культурах, после образования почти сплошного слоя, остаточные клетки 3T3-J2 отделяли с помощью 0,02% ЭДТА, а кератиноциты трипсинизировали 0,05% трипсином/0,02% ЭДТА и повторно высевали при плотности 5×103 клеток/см 2 на обработанные митомицином С клетки 3T3-J2 (2,4×10 4/см2).

 

Вторичные культуры, образовавшие почти сплошной слой, трипсинизировали как описано выше и высевали для экспериментов в бессывороточной среде определенного состава (KGM, Clonetics Corp., San Diego, CA, США).

 

Жизнеспособность клеток определяли по исключению красителя трипана синего.

 

Облучение ультрафиолетом UV-B

 

Облучение ультрафиолетом UV-B проводили с помощью комплекта ламп (TL 20W/12 RS UV-B Philips Medical) до и после обработки диацереином. В других опытах облучение ультрафиолетом UV-B проводили только после добавления диацереина. Перед облучением клетки отмывали один раз PBS и облучали в присутствии PBS.

 

В контрольных опытах проводили имитацию облучения такой же продолжительности с помощью светового радиометра International Light Research Radiometer (Newburyport, MA).

 

Определение пролиферации клеток

 

Нормальные кератиноциты человека (9000 клеток/лунку) выращивали в планшетах на 96 лунок в среде KGM и обрабатывали диацереином или одним растворителем.

 

Подсчет клеток проводили через 24, 48 и 96 часов. Кроме того, за 12 часов до сбора клеток проводили включение 3H-тимидина (1 мкКи/лунку, Amersham-Pharmacia Biotech, Rainham, UK) и собирали клетки через 24, 48, 72 и 96 часов.

 

Включение радиоактивности измеряли на -счетчике.

 

Определения методом ELISA

 

Количественное определение уровня цитокинов проводили методом количественного двухсайтового ферментного иммуноанализа согласно инструкции производителя, используя наборы ELISA для IL-1, IL-6, IL-8 и -TNF.

 

Концентрацию образцов определяли по поглощению при 450 нм с коррекцией при 540 нм.

 

Результаты и их обсуждение

 

1. Жизнеспособность кератиноцитов по исключению трипана синего

 

Для того, чтобы узнать, как диацереин влияет на кератиноциты человека, исследовали возможные изменения жизнеспособности по исключению трипана синего. Как видно из фиг.1А и фиг.1В, повышение дозы диацереина не вызывало значительных изменений жизнеспособности кератиноцитов, кроме доз в 100 и 200 мкМ через 96 часов.

 

Таким образом, показано, что диацереин не влияет на жизнеспособность кератиноцитов.

 

2. Анализ пролиферации клеток

 

Для оценки терапевтического эффекта диацереина при псориазе в культуры кератиноцитов вносили ряд доз препарата и проводили подсчет числа кератиноцитов.

 

Как видно из фиг.2А, через 24 часа после обработки число клеток значительно снижалось только тогда, когда использовали дозы от 10 до 200 мкМ (р<0,05).

 

С другой стороны, как видно из фиг.2В, через 96 часов после обработки наблюдалось четкое дозо-зависимое снижение числа кератиноцитов, начиная с 5 вплоть до 100 мкМ диацереина (р<0,05) (фиг.2А и 2В).

 

Этот результат подтверждается сильным влиянием диацереина на синтез ДНК. В частности, при добавлении диацереина включение 3H-тимидина значительно снижалось дозо-зависимым образом через 24 часа (10-200 мкМ), 48 (1-200 мкМ), 72 и 96 (0,1-200 мкМ) часов после обработки (фиг.3А, 3В, 3С и 3D).

 

В совокупности эти данные означают, что диацереин является сильным ингибитором пролиферации кератиноцитов.

 

3. Анализ выделения IL-1 методом ELISA

 

IL-1 экспрессируется конститутивно в кератиноцитах человека. Выделение IL-1 измеряли после добавления ряда доз диацереина.

 

Как видно из фиг.4А, в нормальных условиях диацереин не влиял на конститутивный уровень IL-1 в кератиноцитах.

 

Поскольку известно, что ультрафиолет является наиболее сильным стимулятором выделения цитокинов, кератиноциты облучали ультрафиолетом UV-B до или после обработки диацереином.

 

Как видно из фиг.4В, UV-B вызывал резкое усиление выделения IL-1, тогда как диацереин предотвращал этот эффект через 24 часа после облучения. В частности, как видно из фиг.4В, диацереин оказывал более сильное действие при внесении его до облучения UV-B.

 

Следует отметить, что препарат обладал способностью подавлять выделение IL-1 почти до исходного уровня уже при 0,1 мкМ.

 

4. Анализ выделения IL-6 методом ELISA

 

В норме IL-6 не обнаруживается в кератиноцитах человека на конститутивном уровне. Поэтому выделение IL-6 стимулировали путем облучения ультрафиолетом UV-В.

 

Диацереин не влиял на уровень IL-6 в исходных условиях (фиг.5А), однако, он вызывал снижение индуцированного UV-B выделения IL-6 через 24 часа после облучения.

 

Диацереин был значительно более эффективным, когда его добавляли и до, и после облучения UV-B. В самом деле, в этом случае значительное снижение выделения IL-6 наблюдалось в дозе 1 мкМ, тогда как требовалось 5 мкМ диацереина для уменьшения IL-6, когда препарат вносили только до облучения UV-B (фиг.5В).

 

5. Анализ выделения IL-8 методом ELISA

 

Как и в случае IL-6 диацереин не влиял на уровень IL-8 в обычных условиях (фиг.6А). Однако, когда выделение IL-8 стимулировали облучением UV-B, диацереин (5-100 мкМ) вызывал значительное снижение уровня этого цитокина через 24 часа. Опять же диацереин был более эффективным, когда его вносили и до, и после облучения UV-B (фиг.6В).

 

Поскольку -TNF является сильным индуктором IL-8 в кератиноцитах и играет важную роль в патогенезе псориаза, исследовали также влияние диацереина на IL-8 после стимуляции кератиноцитов -TNF. Только высокие дозы диацереина (50-200 мкМ) уменьшали индуцированное -TNF выделение IL-8 в кератиноцитах (фиг.6С).

 

6. Анализ выделения -TNF методом ELISA

 

Как указано выше, -TNF имеет большое значение в патогенезе псориаза. Поэтому мы решили исследовать влияние диацереина на выделение этого цитокина из кератиноцитов человека.

 

Диацереин уменьшал индуцированное UV-B выделение -TNF только при высоких дозах (50-200 мкМ) (фиг.7).

 

Описанные выше опыты in vitro показывают, что диацереин может действовать на два наиболее важных патогенетических фактора, ведущих к возникновению псориатических повреждений, - пролиферацию кератиноцитов и изменения в системе цитокинов.

 

Эти опыты показали, что в терапевтических дозах диацереин сильно ингибирует пролиферацию кератиноцитов дозо-зависимым образом, а также что уже при 0,1 мкМ диацереин подавляет выделение IL-1 почти до исходного уровня.

 

Кроме того, эти опыты показали, что диацереин значительно уменьшает индуцированное UV-B выделение IL-6, IL-8 и -TNF, которые играют роль в патогенезе псориаза.

 

Клинические испытания, показывающие эффективность и безопасность фармацевтической композиции, содержащей диацереин, при лечении псориаза и псориатического артрита

 

Целью этого исследования была оценка эффективности и безопасности диацереина при лечении псориаза с легким или умеренным псориатическим артритом.

 

Фармацевтическая композиция

 

Исследуемый препарат - Artrodar® (Laboratoire Medidom S.A., Женева) представляет собой твердые желатиновые капсулы 1-го размера.

 

Лечение

 

Лечение заключалось в приеме 2×50 мг капсул Artrodar® (капсулы содержат по 50 мг диацереина) в день на протяжении 6 месяцев. Одну капсулу принимали после обеда, а другую - после ужина.

 

Прием других лекарств

 

Не разрешался прием медленно действующих лекарств от псориатического артрита или кортикостероидов в течение месяца перед началом испытания и во время испытания. Прием других лекарств, таких как NSAIDs и анальгетики, не прекращался и во время испытания, и их дозы регистрировались каждую неделю.

 

Критерии эффективности

 

Оценивали следующие параметры в исходном состоянии и через регулярные промежутки во время испытания:

 

- индекс PASI (Fredriksson and Peterson, 1978) для оценки степени поражения кожи;

 

- болезненность при движении (в данном суставе) по методике VAS;

 

- суставный индекс Ritchie.

 

Пациента считали положительно реагирующим на лечение, если у него или нее отмечалось уменьшение тяжести псориаза по шкале PASI.

 

Критерии безопасности

 

Отмечались все неблагоприятные случаи, о которых сообщали исследователи или врачи.

 

Результаты по итоговым данным табл. 1 и индивидуальным данным табл. 2

 

В испытании участвовали 10 пациентов с легким или умеренным псориатическим артритом.

 

- Три пациента прошли только начальное обследование, поэтому данные об эффективности отсутствовали на момент составления отчета.

 

- Один пациент принимал препарат только 1 месяц.

 

- Шесть пациентов принимали препарат более 1 месяца.

 

Таким образом, в табл. 1 представлены данные по 7 пациентам, принимавшим препарат не менее 1 месяца (сводные данные). Исходные данные по каждому пациенту изложены в табл. 2 (индивидуальные данные).

 

Все 7 пациентов, принимавших диацереин не менее 1 месяца, положительно реагировали на лечение в той части, что касается псориаза (уменьшение индекса PASI):

 

- 4 пациента проявили улучшение через 1 месяц

 

- 2 пациента проявили улучшение через 2 месяца

 

- 1 пациент проявил улучшение через 3 месяца.

 

Один из этих пациентов выбыл из испытания после 1 месяца лечения из-за диареи. Однако симптомы псориаза и артрита у него сильно улучшились за 1 месяц лечения, поэтому его можно считать положительно реагирующим.

 

Из остальных 3 пациентов один не проявлял никаких улучшений состояния псориаза, поскольку он прошел только 1 месяц лечения, а остальные 2 пациента прошли только начальное обследование.

 

Выводы

 

Из 7 пациентов (включая выбывшего пациента), принимавших диацереин в течение одного месяца или больше, все (100%) положительно реагировали на лечение.

 

Единственный известный отрицательный эффект - это диарея у одного пациента, что заставило его выбыть из испытания.

 

С учетом вышесказанного, диацереин оказался на удивление эффективным при лечении псориаза и связанных с ним заболеваний.

 

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

 

1. Фармацевтическая композиция для лечения псориаза в его различных формах и псориатического артрита, содержащая эффективное количество диацереина или его фармацевтически приемлемых соли или сложного эфира.

 

2. Фармацевтическая композиция по п.1 для лечения псориаза в его различных формах и псориатического артрита, содержащая эффективное количество диацереина.

 

3. Фармацевтическая композиция по п.1, предназначенная для лечения псориаза.

 

4. Фармацевтическая композиция по п.1, предназначенная для лечения псориатического артрита.

 

5. Фармацевтическая композиция по п.1, находящаяся в форме, подходящей для приема внутрь.

 

6. Фармацевтическая композиция по п.1, находящаяся в форме крема или мази для местного нанесения на части кожных покровов, пораженные псориазом.

 

7. Способ лечения псориаза, включающий введение фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество диацереина или его фармацевтически приемлемых соли или сложного эфира.

 

8. Способ лечения псориаза и псориатического артрита, включающий введение фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество диацереина или его фармацевтически приемлемых соли или сложного эфира.

 

9. Способ по п.7 или 8, в котором фармацевтическая композиция находится в форме, подходящей для приема внутрь.

 

 

 

10. Способ по любому из пп.7-9, в котором фармацевтическая композиция содержит дозу, соответствующую ежедневному приему внутрь 30-200 мг диацереина.

 

11. Способ по любому из пп.7-9, в котором дозировка равна 100 мг в день по меньшей мере в два приема.

 

http://www.freepatent.ru/patents/2266740